Regulação reversível das atividades de Cas12a por AcrVA5

Cell Discovery volume 8, Número do artigo: 45 (2022) Citar este artigo

1099 Acessos

1 Citações

Detalhes das métricas

Caro editor,

O sistema agrupado de repetição palindrômica curta regularmente interespaçada (CRISPR)/CRISPR associado (Cas) protege bactérias e archaea de elementos genéticos móveis (MGEs), como bacteriófagos1. O efetor Cas pode ser guiado por um RNA CRISPR (crRNA) para direcionar os ácidos nucleicos invasores por pareamento de bases e, em seguida, cliva o alvo para fornecer imunidade ao hospedeiro2,3. Para lidar com a pressão de imunidade imposta pelo sistema CRISPR do hospedeiro, os fagos desenvolveram diferentes tipos de sistemas anti-CRISPR (Acr) para inativar as nucleases Cas e fechar o sistema de imunidade do hospedeiro por sua vez4. As proteínas Acr podem interagir diretamente com as proteínas Cas para evitar o carregamento do crRNA ou a ligação ao alvo; alternativamente, eles possuem atividades enzimáticas para clivar os crRNAs ou modificar pós-traducionalmente as proteínas Cas4. Entre eles, existe uma acetiltransferase da família GNAT recentemente relatada, chamada AcrVA5, que é codificada pelos MGEs e inibe especificamente o efetor tipo VA Cas12a por meio da modificação de acetil de um sítio chave de lisina. O Cas12a inativado por AcrVA5 perde a capacidade de interagir com o local do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) e falha na proteção dos hospedeiros ao clivar os MGEs invasores5,6. Através da inativação do sistema Cas12a, os MGEs contendo o gene acrVA5 podem efetivamente desligar o sistema de imunidade bacteriana e têm o potencial de se espalhar amplamente entre os hospedeiros que abrigam Cas12a. No entanto, para nossa grande surpresa, o gene acrVA5 existe apenas em três cepas de Moraxella bovoculi que perderam suas desacetilases (Tabela Suplementar S1). Portanto, é razoável suspeitar que possa existir uma relação competitiva entre a acetiltransferase AcrVA5 e as desacetilases bacterianas amplamente distribuídas7, que podem reativar Cas12a por desacetilação para proteger os hospedeiros da invasão de MGEs que abrigam o cassete acrVA5.

Primeiro, realizamos o experimento de acetilação in vitro mediado por AcrVA5 e mostramos que a bactéria Lachnospiraceae (Lb) Cas12a acetilada por AcrVA5 perdeu as atividades de clivagem cis e trans em direção ao DNA alvo de fita dupla (dsDNA) (Fig. complementar S1a, b) , o que foi consistente com as descobertas anteriores5,6, no entanto, o tratamento com AcrVA5 não mostrou efeito nas atividades de transclivagem de LbCas12a quando desencadeado pelo DNA de fita simples alvo (ssDNA) (Fig. Suplementar S1c). Como o sítio PAM é necessário apenas para Cas12a reconhecer o dsDNA alvo, mas não o ssDNA8, os resultados acima confirmaram ainda que a acetilação mediada por AcrVA5 impediu que Cas12a interagisse com as sequências PAM no dsDNA5 alvo.

Além de LbCas12a, também analisamos ortólogos de Cas12a de Francisella tularensis subsp. novicida (FnCas12a) e Acidaminococcus sp. (AsCas12a) e demonstrou que AcrVA5 foi capaz de inativar ambos os ortólogos (Figs. Suplementares. S2 e S3). Notavelmente, AcrVA5 já se mostrou ineficaz contra AsCas12a em um estudo anterior6, no entanto, descobrimos que AsCas12a continha o resíduo de lisina conservado (Fig. complementar S3c) e mostramos que o tratamento mediado por AcrVA5 levou à perda de cis e atividades de transclivagem de AsCas12a com dsDNA alvo.

A acetilação de lisina pós-traducional desempenha um papel importante em diversos processos celulares em organismos, desde bactérias até humanos9. Em bactérias, o CobB do tipo sirtuína dependente de NAD+ desacetila um grande número de proteínas e regula o nível de acetilação global7. Para testar se a CobB pode desacetilar a Cas12a tratada com AcrVA5 e reativar suas atividades de clivagem cis e trans, então purificamos E. coli CobB e LbCas12a recombinantes e realizamos o ensaio de desacetilação in vitro. Com base nos resultados de western blot, Cas12a foi acetilado com sucesso por AcrVA5 na presença de acetil-CoA, e a modificação de acetil pode ser removida com eficiência após ser tratada por CobB. Consistente com descobertas anteriores7, a desacetilação mediada por CobB requer rigorosamente NAD+ como cofator (Fig. complementar S4). Consequentemente, o LbCas12a acetilado por AcrVA5 perdeu as atividades de clivagem cis e trans com o dsDNA alvo, mas recuperou ambas as atividades em grande parte após ser desacetilado por CobB (Fig. 1a, b). Além disso, testamos vários ortólogos de Cas12a, como FnCas12a e AsCas12a, e descobrimos que CobB foi capaz de desacetilar e reativar ambos os ortólogos de Cas12a (Figs. Suplementares. S5–S8). Vale a pena mencionar que a reativação bem-sucedida de AsCas12a acetilado pelo tratamento com CobB provou mais uma vez que AsCas12a é um alvo de AcrVA5 (Fig. S3 complementar), enquanto a razão para os resultados distintos entre este trabalho e o estudo anterior6 ainda era desconhecida e poderia ser uma questão interessante sujeita a uma investigação mais aprofundada. Com base nos resultados acima, pode-se concluir que AcrVA5 e CobB regulam reversivelmente as atividades de clivagem cis e trans de Cas12a modulando seu status de acetil in vitro.