Respostas preferenciais de anticorpos de coelho a C

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 9156 (2023) Cite este artigo

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Anticorpos criados em coelhos imunizados com peptídeos têm sido usados ​​em pesquisas biológicas há décadas. Embora tenha havido ampla implementação dessa abordagem, proteínas específicas são ocasionalmente difíceis de atingir por vários motivos. Uma consideração observada em camundongos é que as respostas humorais podem atingir preferencialmente o terminal carboxila da sequência peptídica que não está presente na proteína intacta. Para lançar luz sobre a frequência de respostas preferenciais de anticorpos de coelho aos terminais C de imunogênios peptídicos, apresentamos nossa experiência com a geração de anticorpos de coelho para NOTCH3 humano. Um total de 23 anticorpos foram criados contra 10 sequências peptídicas de NOTCH3 humano. Mais de 70% (16 de 23) desses anticorpos policlonais foram determinados como tendo preferência por C-terminal: os anticorpos reativos ao peptídeo NOTCH3 visaram amplamente o grupo carboxila livre de terminação do peptídeo imunizante. Os anticorpos que preferiam epítopos C-terminal reagiram fracamente ou não reagiram com sequências alvo recombinantes com extensão do C-terminal que eliminou o grupo carboxila livre da estrutura do imunógeno; além disso, cada um destes anti-soros não revelou qualquer reactividade de anticorpo para proteínas truncadas antes do terminal C do imunogénio. Em aplicações imunocitoquímicas desses anticorpos antipeptídeos, encontramos similarmente reatividade a alvos recombinantes que se ligam melhor a células que expressam o C-terminal livre da sequência imunizante. Em conjunto, nossa experiência demonstra uma forte propensão para coelhos para montar respostas de anticorpos para epítopos C-terminais de peptídeos derivados de NOTCH3, que é previsto para limitar seu uso contra a proteína nativa. Discutimos algumas abordagens potenciais para superar esse viés que poderiam melhorar a eficiência da geração de anticorpos neste paradigma experimental comumente utilizado.

O desenvolvimento e aplicação de anticorpos de pesquisa tem sido indispensável para o estudo de proteínas. Entre os anticorpos de pesquisa, os anti-soros antipeptídeos ganharam um favor significativo, em grande parte devido à elucidação de um grande número de sequências genéticas codificadoras de proteínas e aos avanços tecnológicos na síntese de peptídeos. Esses avanços permitem a produção de antissoros, geralmente sem dificuldade, imunizando animais sem a necessidade de produzir ou purificar alvos proteicos1,2.

Embora amplamente bem-sucedida, a imunização antipeptídeo às vezes falha na geração de anticorpos úteis para a detecção de alvos proteicos1,3. Falhas têm sido atribuídas à incapacidade do antígeno peptídico de adotar a mesma conformação da proteína alvo4, enterramento da sequência alvo em regiões inacessíveis5, ou à modificação pós-traducional da proteína alvo que não é refletida no imunógeno peptídico.

Em um estudo anterior, Liang e colegas6 observaram outra razão potencial para a falha na geração de anticorpos antipeptídeo utilizáveis: direcionamento preferencial de anticorpos para o terminal carboxila (terminal C) de peptídeos imunizantes que não está presente na proteína intacta. Eles relataram que a imunização de camundongos com um epítopo interno de C-CAM1 produziu uma resposta de anticorpo principalmente para a extremidade C-terminal do peptídeo imunizante; os anticorpos monoclonais dos camundongos reagiram ao peptídeo imunizante de uma maneira dependente do terminal C do imunógeno, mas esses anticorpos não se ligaram à proteína intacta. Os investigadores concluíram que os anticorpos monoclonais derivados de camundongos exigiam a porção carboxilato presente no terminal C, que foi eliminada pela ligação peptídica presente na proteína intacta.

Em outro estudo, Edwards e colegas7 desenvolveram uma abordagem bem-sucedida para gerar anticorpos contra proteínas bacterianas que dependiam da imunização de coelhos com pequenos peptídeos correspondentes aos terminais C de proteínas individuais. Este estudo indicou que os coelhos eram capazes de gerar respostas efetivas aos terminais C de peptídeos e que os anti-soros gerados para imunogênios curtos eram notavelmente específicos. A proporção relativa de anticorpos que preferiam os terminais C dos imunogênios peptídicos foi alta para vários anticorpos relatados, conforme avaliado por competição peptídica de ensaios ELISA.