A evolução da resistência à cloroquina em Plasmodium falciparum é mediada pelo suposto transportador de aminoácidos AAT1

Nature Microbiology (2023) Cite este artigo

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Os parasitas da malária quebram a hemoglobina do hospedeiro em peptídeos e aminoácidos no vacúolo digestivo para exportação para o citoplasma do parasita para crescimento: a interrupção desse processo é fundamental para o modo de ação de vários medicamentos antimaláricos. Mutações no transportador de resistência à cloroquina (CQ), pfcrt, localizado na membrana do vacúolo digestivo, conferem resistência à CQ no Plasmodium falciparum e normalmente também afetam a aptidão do parasita. No entanto, o papel de outros loci do parasita na evolução da resistência à CQ não é claro. Aqui usamos uma combinação de genômica populacional, cruzamentos genéticos e edição de genes para demonstrar que um segundo transportador vacuolar desempenha um papel fundamental tanto na resistência quanto na evolução compensatória. Análises genômicas longitudinais dos parasitas da Gâmbia revelaram assinaturas temporais de seleção em um transportador de aminoácidos putativo (pfaat1) variante S258L, que aumentou de 0% para 97% em frequência entre 1984 e 2014 em paralelo com a variante pfcrt1 K76T. Os cruzamentos genéticos do parasita identificaram um locus de característica quantitativa do cromossomo 6 contendo pfaat1 que é selecionado pelo tratamento CQ. A edição de genes demonstrou que pfaat1 S258L potencializa a resistência CQ, mas a um custo de aptidão reduzida, enquanto pfaat1 F313S, um polimorfismo comum do sudeste asiático, reduz a resistência CQ enquanto restaura a aptidão. Nossas análises revelam uma complexidade oculta na evolução da resistência ao CQ, sugerindo que o pfaat1 pode estar por trás das diferenças regionais na dinâmica da evolução da resistência e modular a resistência ou aptidão do parasita, manipulando o equilíbrio entre o transporte de aminoácidos e drogas.

A resistência aos medicamentos em patógenos microbianos complica os esforços de controle. Portanto, entender a arquitetura genética e a complexidade da evolução da resistência é fundamental para o monitoramento da resistência e o desenvolvimento de melhores estratégias de tratamento. No caso dos parasitas da malária, a implantação de cinco classes de medicamentos antimaláricos ao longo do último meio século resultou em varreduras seletivas duras e suaves bem caracterizadas associadas à resistência aos medicamentos, com disseminação mundial e origens locais de resistência, impulsionando alelos de resistência aos medicamentos em todo o mundo. gama de Plasmodium falciparum1,2,3. A monoterapia com cloroquina (CQ) teve um papel central em um plano ambicioso para erradicar a malária no século passado. A resistência à CQ foi observada pela primeira vez em 1957 no sudeste da Ásia (SEA), e posteriormente chegou e se espalhou pela África a partir do final da década de 1970, contribuindo para o fim desse ambicioso esforço global de erradicação4.

A resistência à CQ tem sido estudada intensivamente. O gene transportador de resistência CQ (pfcrt, cromossomo (chr.) 7) foi originalmente identificado usando um cruzamento genético de P. falciparum conduzido entre um parasita SEA resistente a CQ e um parasita sul-americano sensível a CQ gerado em um hospedeiro chimpanzé5,6. Vinte anos de intensa pesquisa revelaram o papel mecanicista do transportador de resistência à cloroquina (pfCRT) na resistência a drogas7,8, sua localização na membrana do vacúolo digestivo e sua função natural de transportar peptídeos curtos do vacúolo digestivo para o citoplasma9. A CQ mata os parasitas interferindo na digestão da hemoglobina no vacúolo digestivo, impedindo a conversão do heme, um subproduto tóxico da digestão da hemoglobina, em cristais inertes de hemozoína. Os parasitas portadores de mutações de resistência à CQ no pfCRT transportam a CQ para fora do vacúolo alimentar, longe do local de ação da droga7,8. O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) pfcrt K76T é amplamente utilizado como um marcador molecular para resistência a CQ10, enquanto variantes adicionais dentro de pfcrt modulam os níveis de resistência a CQ11 e outras drogas de quinolina12 e determinam os custos de aptidão associados13. Embora as mutações em um segundo transportador localizado na membrana do vacúolo alimentar, o transportador de resistência a múltiplas drogas (pfmdr1), tenham demonstrado modular a resistência à CQ em alguns backgrounds genéticos14, o papel de outros genes na evolução da resistência à CQ permanece obscuro. Neste artigo, procuramos entender a contribuição de loci parasita adicionais para a evolução da resistência CQ usando uma combinação de genômica populacional, cruzamentos genéticos experimentais e edição de genes.

2%), we retained 16,385 biallelic SNP loci from 321 isolates (1984 (134), 1990 (13), 2001 (34), 2008 (75) and 2014 (65)). The pfcrt K76T mutation associated with CQ resistance increased from 0% in 1984 to 88% in 2014. Notably, there was also rapid allele frequency change on chr. 6: the strongest differentiation is seen at an S258L mutation in a putative amino acid transporter, pfaat1 (PF3D7_0629500, chr. 6), which increased during the same time period from 0% to 97% (Fig. 1a). Assuming a generation time (mosquito to mosquito) of 6 months for malaria parasites, these changes were driven by selection coefficients of 0.18 for pfaat1 S258L, and 0.11 for pfcrt K76T (Extended Data Fig. 1). Both pfaat1 S258L and pfcrt K76T mutations were absent in 1984 samples, but present in 1990, suggesting that they arose and spread in a short time window. Both pfaat1 and pfcrt showed similar temporal haplotype structures in Gambia (Extended Data Fig. 2). These were characterized by almost complete replacement of well-differentiated haplotypes at both loci between 1984 and 2014. During this period, we also observed major temporal changes in another known drug resistance locus (pfdhfr) (chr. 4)16 (Fig. 1b). That these rapid changes in allele frequency occur at pfcrt, pfaat1 and pfdhfr, but not elsewhere in the genome (Fig. 1b), provides unambiguous evidence for strong directional selection./p>30 and supported ≥5 reads per allelic variant were retained. SNPs with minor allele frequency <2% were removed from our analysis. We also removed samples with >10% genotypes missing. In the final dataset, there were in total 16,385 biallelic SNP loci and 321 isolates (1984 (134), 1990 (13), 2001 (34), 2008 (75) and 2014 (65)). The complexity of infection (monogenomic or polygenomic) was estimated as the inbreeding coefficient Fws from the merged VCF file using R package Biomix. The short-read sequence data analysed are listed in Supplementary Table 1./p>90% IBD./p>5 were considered as regions of interest./p> 0.90) and >50% of SNP loci genotyped were included for further analysis. A total of 4,051 samples remained after filtration (Supplementary Table 2). Non-biallelic SNPs and heterozygous variant calls were further removed from the dataset. We then extracted genotype data at pfaat1 and pfcrt gene regions and calculated the allele frequencies (Fig. 2a)./p>100× genome coverage per sample./p> 20 (ref. 57). Once a QTL was detected, we calculated an approximate 95% confidence interval using Li's method58 to localize causative genes./p>

90% IBD. Each point depicts an isolate with point colors representing the years from which they were sampled. Square points represent complex infections and circles represent monoclonals. MOI, multiplicity of infection./p>90% of the genomes are IBD, only one representative sample with the highest genotype rate was selected and used for IBD analysis. Sample numbers are shown in each panel. Chromosome boundaries are indicated with grey dashed vertical lines. The location of pfaat1 and pfcrt are indicated with red arrows on top of each panel. The chr 10 peak (West Africa, A) contains pfmspdbl2 associated with decreased sensitivity to halofantrine, mefloquine and lumefantrine69. The chr 8 peak (East Africa and Asia (C-H)) contains dihydropteroate synthase (sulfadoxine resistance)70 and the chr 12 peak (D-F) contains GTP cyclohydrolase I, a compensatory locus for antifolate drugs71. See also analyses by Amambua-Ngwa et al.17, Hendon et al.18, and Carrasquilla et al.19./p>