Revelando as proteoformas de Corynebacterium glutamicum através do topo

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 2602 (2023) Cite este artigo

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Corynebacterium glutamicum é uma bactéria amplamente empregada na produção industrial de aminoácidos, bem como em uma ampla gama de outros produtos biotecnológicos. O presente estudo descreve a caracterização de proteoformas de C. glutamicum e suas modificações pós-traducionais (PTMs) empregando proteômica top-down. Apesar das evidências anteriores de que os PTMs desempenham papéis na regulação do metabolismo de C. glutamicum, esta é a primeira análise de proteoma top-down deste organismo. Identificamos 1125 proteoformas de 273 proteínas, com 60% das proteínas apresentando pelo menos um deslocamento de massa, sugerindo a presença de PTMs, incluindo várias proteoformas acetiladas, oxidadas e formiladas. Além disso, proteínas relevantes para a produção de aminoácidos, secreção de proteínas e estresse oxidativo foram identificadas com deslocamentos de massa sugerindo a presença de PTMs e proteoformas não caracterizadas que podem afetar processos biotecnologicamente relevantes neste burro de carga industrial. Por exemplo, as proteínas de membrana mepB e SecG foram identificadas como proteoformas clivadas e formiladas, respectivamente. Enquanto no metabolismo central, OdhI foi identificado como duas proteoformas com potencial relevância biológica: uma proteoforma clivada e uma proteoforma com PTMs correspondendo a um deslocamento de massa de 70 Da.

A bactéria Corynebacterium glutamicum é um burro de carga industrial capaz de produzir uma ampla gama de biomoléculas a partir de um grande pool de substratos1 e é atualmente a melhor opção para produção de aminoácidos L-alfa2. A produção de aminoácidos representa um mercado multibilionário3, com uma produção anual de aproximadamente 10 milhões de toneladas em todo o mundo2, sendo que o l-glutamato e a l-lisina correspondem a 3,3 milhões de toneladas/ano e 2,2 milhões de toneladas/ano, respectivamente2. Além da produção de aminoácidos, C. glutamicum também é utilizado em outros processos biotecnológicos, como a produção de proteínas heterólogas4, ácidos orgânicos5, carotenóides, isobutanol6, polímeros7 e, mais recentemente, seu potencial em processos de biorremediação tem sido investigado8.

Desenvolvimentos recentes em proteômica demonstraram a importância das modificações pós-translacionais (PTMs) em várias espécies de bactérias9. Em C. glutamicum, a importância dos PTMs foi investigada anteriormente, revelando o efeito crucial da fosforilação do inibidor da oxoglutarato desidrogenase (OdhI) na produção de l-glutamato10,11. Mais recentemente, espectrometria de massa proteômica de C. glutamicum mostrou a influência das condições de produção de l-glutamato na succinilação e acetilação de proteínas metabólicas de C. glutamicum, incluindo OdhI12.

Atualmente, existem duas abordagens proteômicas principais, denominadas de baixo para cima e de cima para baixo. Resumidamente, na abordagem bottom-up, as proteínas são clivadas por uma protease (geralmente tripsina) e os peptídeos subsequentes são analisados por espectrometria de massa, enquanto no procedimento top-down, as proteínas são examinadas em suas formas intactas13. Como consequência da digestão por protease, as informações de várias regiões da proteína podem ser perdidas em abordagens de baixo para cima, incluindo PTMs. Além disso, nesta abordagem a identidade da proteína é inferida com base na identificação do peptídeo, e isso pode causar ambiguidade nos casos em que os peptídeos podem pertencer a mais de uma proteína13. Em contraste, a abordagem top-down permite a identificação da sequência completa de proteínas. Além disso, a análise de formas intactas de proteínas permite a identificação de proteoformas, definidas como diferentes formas de proteínas derivadas de um mesmo gene14. Tais proteoformas podem ser geradas por substituição de resíduos de aminoácidos, clivagem proteolítica, splicing alternativo e vários tipos de PTMs15. Além disso, diferentes proteoformas da mesma proteína podem ter diferentes funções e afetar os processos biológicos de um organismo16. O poder da proteômica de cima para baixo foi aplicado a outras bactérias17. Por exemplo, foi realizada proteômica top-down de Escherichia coli e a identificação de proteoformas18. Apesar da evidência da relevância dos PTMs no metabolismo de C. glutamicum, nenhum estudo proteômico top-down foi publicado até o momento. Aqui realizamos a primeira análise proteômica top-down de C. glutamicum, usando uma abordagem tolerante a precursores para identificar e revelar PTMs e proteoformas.

Pro or UnimodAC: 1145, Δm = −1.997892 Da, Met- > Glu) or didehydro (UnimodAC: 401, Δm = −2.015650 Da) in the modified region. Moreover, several PrSMs were identified with Δm of approx. 30 Da. Inspection of its spectra resulted in the confirmation of this mass shift, but it is more likely that it resulted from two PTMs, one of 14 Da and other of 16 Da (supplementary Fig. S6), possibly corresponding to methylation and oxidation, respectively. Furthermore, an isotopic envelope could be detected near this identified proteoform (Δm = 30 Da) with the intact mass of the −2 Da modification of HMADP (supplementary Fig. S6, precursor in blue)./p>