Geração de um parasita mutante para impulsionar a descoberta do resistoma em Plasmodium falciparum

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 3059 (2023) Citar este artigo

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A evolução in vitro da resistência aos medicamentos é uma abordagem poderosa para identificar alvos antimaláricos, no entanto, os principais obstáculos para provocar resistência são o tamanho do inóculo do parasita e a taxa de mutação. Aqui, procuramos aumentar a diversidade genética do parasita para potencializar as seleções de resistência editando resíduos catalíticos da DNA polimerase δ do Plasmodium falciparum. Os ensaios de acúmulo de mutação revelam uma elevação de ~ 5 a 8 vezes na taxa de mutação, com um aumento de 13 a 28 vezes nas linhas sob pressão de drogas. Após o desafio com o inibidor de espiroindolona PfATP4 KAE609, a resistência de alto nível é obtida mais rapidamente e com menor inoculação do que parasitas de tipo selvagem. As seleções também produziram mutantes com resistência a um composto "irresistível", MMV665794, que falhou em produzir resistência com outras cepas. Validamos mutações em um gene previamente não caracterizado, PF3D7_1359900, que denominamos proteína de resistência à quinoxalina (QRP1), como causadora da resistência a MMV665794 e um painel de análogos da quinoxalina. O repertório genético aumentado disponível para este parasita "mutador" pode ser aproveitado para impulsionar a descoberta do resistoma P. falciparum.

A descoberta de medicamentos antimaláricos tem procurado ativamente por medicamentos novos ou aprimorados para tratar e, finalmente, eliminar a malária. As atuais terapias combinadas baseadas em artemisinina (ACTs) de linha de frente para Plasmodium falciparum foram comprometidas pelo surgimento de parasitas que são menos suscetíveis à artemisinina e aos medicamentos parceiros no Sudeste Asiático, um epicentro da resistência antimalárica1,2. Além disso, a resistência à artemisinina é uma ameaça à saúde pública de pessoas que vivem em regiões endêmicas em todo o mundo, conforme exemplificado por relatórios recentes sobre o surgimento de mutações kelch13 em isolados de Ruanda e Uganda que causam suscetibilidade reduzida à artemisinina3,4. Muitos compostos antimaláricos promissores com boa potência e atividade em vários estágios foram descobertos usando triagem baseada em fenótipos de células inteiras5. No entanto, esta abordagem apresenta dificuldades para otimização de chumbo devido à falta de conhecimento do alvo molecular. Uma compreensão mais profunda do alvo do medicamento, modo de ação e mecanismo de resistência pode levar ao desenvolvimento de medicamentos melhores que possam resistir à resistência aos medicamentos6,7,8. Além disso, o conhecimento do alvo da droga ou do gene de resistência fornece marcadores moleculares para vigilância epidemiológica genômica no campo para monitorar a disseminação e contenção da resistência a drogas9,10.

A evolução in vitro da resistência aos medicamentos, seguida da análise de todo o genoma, tornou-se uma abordagem fundamental para a identificação de alvos de medicamentos, ajudando a definir modos de ação, bem como mecanismos e propensões para resistência11,12,13. Uma seleção típica de resistência in vitro é realizada usando inóculos de parasitas variando de 105 a 109 parasitas, que são expostos a um composto antimalárico em uma concentração capaz de matar todos os parasitas sensíveis a drogas8,14,15. Os parasitas recrudescentes podem então ser submetidos ao sequenciamento de todo o genoma para identificar o gene subjacente responsável pelo fenótipo de resistência. O principal obstáculo para o sucesso é o prolongamento ou, em alguns casos, a incapacidade total de selecionar parasitas resistentes, independentemente do regime de seleção ou do histórico da cepa. Este processo trabalhoso e demorado pode, portanto, não identificar um alvo molecular ou um mecanismo de ação definido para os compostos de consulta. Por exemplo, em um conjunto de seleções de resistência in vitro com 48 compostos pelo Malaria Drug Accelerator Consortium (MalDA), 23 compostos produziram parasitas resistentes com resistência observada após 15 a 300 dias16. Os compostos que falham em produzir parasitas resistentes após várias tentativas e condições foram denominados "irresistíveis"17. Embora possa haver várias razões possíveis para os compostos serem aparentemente "irresistíveis", sua baixa propensão à resistência é uma qualidade atraente de uma perspectiva de descoberta de drogas antimaláricas e, portanto, insights sobre seu mecanismo de ação seriam valiosos.